中国水稻科学
     首页  |  期刊介绍  |  编 委 会  |  投稿指南  |  期刊订阅  |  广告服务  |  留言板  |  联系我们  |  English
中国水稻科学  2010, Vol. 24 Issue (6): 617-622     DOI: 10.3969/j.issn.1001-7216.2010.06.009
研究报告 最新目录 | 下期目录 | 过刊浏览 | 高级检索  |   
根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立
杨迎青#;杨媚#;李明海;李勇;贺晓霞;周而勋*
华南农业大学 植物病理学系, 广东 广州 510642; #共同第一作者; *通讯联系人, E-mail: exzhou@scau.edu.cn
Establishment of Agrobacterium tumefaciensMediated Transformation System for Rhizoctonia solani AG-1 ⅠA, the Causal Agent of Rice Sheath Blight
YANG Ying-qing#, YANG Mei#, LI Ming-hai, LI Yong, HE Xiao-xia, ZHOU Er-xun*
Department of Plant Pathology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; #These authors contributed equally to this paper; *Corresponding author, E-mail: exzhou@scau.edu.cn
 全文: PDF (2118 KB)   HTML (1 KB)   输出: BibTeX | EndNote (RIS)      背景资料
摘要 为建立水稻纹枯病菌的TDNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG1 ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30 μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8 h,共培养20 h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200 μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH 56~58。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30 μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500 bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730 bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,TDNA已经插入到目标菌株GD118中。
服务
把本文推荐给朋友
加入我的书架
加入引用管理器
E-mail Alert
RSS
作者相关文章
杨迎青
杨媚
李明海
李勇
贺晓霞
周而勋
关键词水稻纹枯病   立枯丝核菌   根癌农杆菌介导转化   T-DNA插入诱变   方法     
Abstract In order to construct the TDNA insertional mutagenesis transformation system for rice sheath blight pathogen Rhizoctonia solani AG1 ⅠA, the virulent isolate GD118 of this pathogen was selected as the initial isolate for transformation. The conditions for the transformation of GD118 were optimized in 5 aspects, i.e. preinduction time, coculture time, acetosyringone concentration at coculture stage, coculture temperature and pH values of solid induction medium (SIM) at coculture phase. Finally, an Agrobacterium tumefaciensmediated transformation (ATMT) system for R. solani AG1 ⅠA was established successfully. The optimal conditions for this ATMT system are as follows: the concentration of hygromycin B at 30 μg/mL for transformant screening, 8 h of preinduction time, 20 h of coculture time, 200 μmol/L of acetosyringone in SIM at coculture stage, coculture temperature at 25℃ and pH 5.6 to 5.8 of SIM at coculture phase. The transformants still showed high resistance to hygromycin B after 5 generations’ subcultures. Ten transformants were randomly picked out for PCR verification using the specific primers designed from the hph gene, and the results revealed that an expected band of 500 bp was amplified from all of the 10 transformants. Meantime, PCR amplification for these 10 transformants was carried out using specific primers designed from the Vir gene of A. tumefaciens, with 4 strains of A. tumefaciens as positive controls for eliminating the falsepositive caused by A. tumefaciens′s contamination, and the results showed that an expected band of 730 bp could be amplified from the 4 strains of A. tumefaciens, whereas no corresponding DNA band could be amplified from the 10 transformants. The results of above two PCR amplifications clearly showed that TDNA was indeed inserted into the targeted isolate GD118.
Key wordsrice sheath blight   Rhizoctonia solani   Agrobacterium tumefaciensmediated transformation   TDNA insertional mutagenesis   methodology   
收稿日期: 1900-01-01;
引用本文:   
杨迎青,杨媚,李明海等. 根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立 [J]. 中国水稻科学, 2010, 24(6): 617-622 .
YANG Ying-qing#,YANG Mei#,LI Ming-hai et al. Establishment of Agrobacterium tumefaciensMediated Transformation System for Rhizoctonia solani AG-1 ⅠA, the Causal Agent of Rice Sheath Blight[J]. , 2010, 24(6): 617-622 .
 
[1] Lee F N, Rush M C. Rice sheath blight: A major rice disease. Plant Dis, 1983, 67(7): 829-832.
[2] 周而勋, 曹菊香, 杨媚, 等. 我国南方六省 (区)水稻纹枯病菌遗传多样性的研究. 南京农业大学学报, 2002, 25(3): 36-40.
[3] 周而勋, 杨媚, 陈友林. 土壤环境因素对水稻纹枯病菌腐生定殖能力的影响. 植物病理学报, 2002, 32(3): 214-218.
[4] 黄世文, 王玲, 陈惠哲, 等. 氮肥施用量和施用方法对超级杂交稻纹枯病发生的影响. 植物病理学报, 2009, 39(1): 104-109.
[5] 肖勇, 刘明伟, 李刚, 等. 四川省水稻立枯丝核菌的遗传分化与致病力. 中国水稻科学, 2008, 22(1): 87-92. 浏览
[6] 黄江华, 杨媚, 周而勋, 等. 13种植物丝核菌对水稻、甜玉米、黄瓜和甘蓝的交互致病性. 华中农业大学学报, 2008, 27(2): 198-203.
[7] Cubeta M A, Vilgalys R. Population biology of the Rhizoctonia solani complex. Phytopathology, 1997, 87: 480-484.
[8] Ogoshi A. Ecology and pathogenicity of anastomosis and intraspecific groups of Rhizoctonia solani Kühn. Ann Rev Phytopathol, 1987, 25: 125-143.
[9] Stodart B J, Harvey P R, Neate S M, et al. Genetic variation and pathogenicity of anastomosis group 2 isolates of Rhizoctonia solani in Australia. Mycol Res, 2007, 111: 891-900.
[10] 王政逸, 李德葆. 限制酶介导的遗传转化及其在丝状真菌中的应用. 菌物系统, 2001, 20(1): 142-147.
[11] Mullins E D, Kang S. Transformation: A tool for studying fungal pathogens of plants. Cell Mol Life Sci, 2001, 58: 2043-2052.
[12] Combier J P, Melayah D, Raffier C, et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in the symbiotic ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum. FEMS Microbiol Lett, 2003, 220(1): 141-148.
[13] Michielse C B, Hooykaas P J J, van den Hondel C A, et al. Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi. Curr Genet, 2005, 48(1): 1-17.
[14] 李敏慧, 张荣, 姜大刚, 等. 根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种的转化. 植物病理学报, 2009, 39(4): 405-412.
[15] Wu J, O′Brien P A. Stable transformation of Rhizoctonia solani with a modified hygromycin resistance gene. Australas Plant Pathol, 2009, 38: 79-84.
[16] Robinson H L, Deacon J W. Protoplast preparation and transient transformation of Rhizoctonia solani. Mycol Res, 2001, 105(11): 1295-1303.
[17] Sawada H, Ieki H, Matsuda I. PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains. Appl Environ Microbiol, 1995, 61(2): 828-831.
[18] Tsuji G, Fujii S, Fujihara N, et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium. J General Plant Pathol, 2003, 69(4): 230-239.
[19] Meyer V, Mueller D, Strowig T, et al. Comparison of different transformation methods for Aspergillus giganteus. Curr Genet, 2003, 43(5): 371-377.
[20] Takahara H, Tsuji G, Kubo Y, et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for random mutagenesis of Colletotrichum trifolii. J General Plant Pathol, 2004, 70(2): 93-96.
[21] Rogers C W, Challen M P, Green J R, et al. Use of REMI and Agrobacterium-mediated transformation to identify pathogenicity mutants of the biocontrol fungus, Coniothyrium minitans. FEMS Microbiol Lett, 2004, 241(2): 207-214.
[22] 迟彦, 周东坡, 平文祥, 等. 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用.菌物学报, 2005, 24(4): 612-619.
[23] Samils N, Elfstrand M, Czederpiltz D L, et al. Development of a rapid and simple Agrobacterium tumefaciens mediated transformation system for the fungal pathogen Heterobasidion annosum. FEMS Microbiol Lett, 2006, 255(1): 82-88.
[24] Turk S C H J, Melchers L S, Dulk-Ras H D, et al. Environmental conditions differentially affect vir gene induction in different Agrobacterium strains: Role of the Vir A sensor protein. Plant Mol Biol, 1991, 16: 1051-1059.
[25] Rogowsky P M , Close T J, Chimera J A, et al. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTi C58. J Bacteriol, 1987, 169(11): 5101-5112.
[26] Stachel S E, Zambryski P C. Agrobacterium tumefaciens and the susceptible plant cell: A novel adaptation of extracellular recognition and DNA conjugation. Cell, 1986, 47(2): 155-157.
[1] 邹成佳,唐芳,杨媚,贺晓霞,李献军,周而勋. 华南3省(区)水稻纹枯病菌的生物学性状与致病力分化研究[J]. 中国水稻科学, 2011, 25(2): 206-202 .
[2] 徐德进,顾中言,徐广春,许小龙,范鹏. 药液表面张力与喷雾方法对雾滴在水稻植株上沉积的影响[J]. 中国水稻科学, 2011, 25(2): 213-218 .
[3] 季英华,高瑞珍, ,张野,程兆榜,周彤,范永坚,周益军, . 一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法[J]. 中国水稻科学, 2011, 25(1): 91-94 .
[4] 王玲,黄雯雯,黄世文,刘连盟,刘恩勇, . 皖鄂地区水稻纹枯病菌致病力分化研究[J]. 中国水稻科学, 2010, 24(6): 623-629 .
[5] 孙川, 陈刚,饶玉春,张光恒,高振宇,刘坚,鞠培娜,胡江,郭龙彪,钱前,曾大力,. 水稻基因组DNA简易制备方法[J]. 中国水稻科学, 2010, 24(6): 677-680 .
[6] 周彤,吴丽娟,王英,程兆榜,季英华,范永坚,周益军. 灰飞虱从冷冻病叶获得水稻黑条矮缩病毒方法的研究初报[J]. 中国水稻科学, 2010, 24(4): 425-428 .
[7] 陈涛,张震,柴荣耀,王教瑜,毛雪琴,邱海萍,杜新法,姜华,王立安. 浙江省水稻纹枯病菌的遗传分化与致病力研究[J]. 中国水稻科学, 2010, 24(1): 67-72 .
[8] 肖勇 ,李双成,初明光 ,周鹏,关鹏,柳莉,王玲霞,郑爱萍,李平,. 水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析[J]. 中国水稻科学, 2008, 22(5): 541-544 .
[9] 敖雁,胡治球,汤在祥,王学枫,徐辰武. 多亲本杂交衍生的多个相关群体QTL作图的通用方法[J]. 中国水稻科学, 2008, 22(4): 427-431 .
[10] 肖勇,刘明伟,李刚,周而勋,王玲霞,唐杰,谭芙蓉,郑爱萍,李平,. 四川省水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的遗传分化与致病力[J]. 中国水稻科学, 2008, 22(1): 87-92 .
[11] 文李,刘盖,李绍清,李国民,陶钧,朱英国,. 水稻花粉总蛋白质双向凝胶电泳方法建立及应用[J]. 中国水稻科学, 2007, 21(1): 13-19 .
[12] 余初浪,严顺平,孙卫宁,杨玲,. 适于水稻根、叶、悬浮细胞总蛋白质分析的高分辨率双向电泳方法[J]. 中国水稻科学, 2006, 20(5): 549-552 .
[13] 孙成效, 段彬伍 ,谢黎虹,陈能. 利用近红外透射光谱技术同步测定糙米的多项品质指标初报[J]. 中国水稻科学, 2006, 20(4): 451-454 .
[14] 刘朋娟,王政逸,王秋华,李德葆. 农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选[J]. 中国水稻科学, 2006, 20(3): 231-237 .
[15] 段桂芳,张建萍,周勇军,余柳青,袁勤生,. 禾长蠕孢菌及其代谢产物Ophiobolin A防治水稻纹枯病[J]. 中国水稻科学, 2006, 20(3): 337-339 .
[16] 孙淑斌,李宝珍,胡江,徐国华. 水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用[J]. 中国水稻科学, 2006, 20(1): 8-12 .
[17] 水稻,硅含量,测定方法. 测定水稻硅含量的一种简易方法[J]. 中国水稻科学, 2005, 19(5): 460-462 .
[18] 毛兴学,肖昕,陈建伟,罗文永,刘彦卓,李晓方. PCR一步法检测水稻蜡质基因第一内含子剪接供体+1位碱基[J]. 中国水稻科学, 2005, 19(3): 285-287 .
[19] 张海燕, 董海涛, 姚海根, 向跃武, 谭学林, 方永启, 邓晔, 金庆超, Cabezas DANIEL, 姜玉新, 戴承恩, 阎文昭, 李德葆. 冻融法纯化水稻胚乳RNA及稻米品质重要相关基因表达谱研究[J]. 中国水稻科学, 2005, 19(2): 105-110 .
[20] 唐绍清, 石春海, 焦桂爱, 胡培松, 王海莲, 万建民. 利用近红外反射光谱技术测定稻米中脂肪含量的研究初报[J]. 中国水稻科学, 2004, 18(6): 563-566 .
[21] 成 芳, 应义斌. 杂交水稻种子特征特性视觉检验分析与图像信息库的建立[J]. 中国水稻科学, 2004, 18(5): 461-465 .
[22] 尚艳芬, 侯彩云, 常国华, 周小丰. 整精米自动识别方法的研究[J]. 中国水稻科学, 2004, 18(5): 466-468 .
[23] 王建飞, 陈宏友, 杨庆利, 姚明哲, 周国安, 张红生,. 盐胁迫浓度和胁迫时的温度对水稻耐盐性的影响[J]. 中国水稻科学, 2004, 18(5): 449-454 .
[24] 沈 波, 平霄飞, 汤富彬, 颜红岚,王 熹. 高压液相色谱法检测水稻根系伤流液中细胞分裂素类物质[J]. 中国水稻科学, 2004, 18(4): 362-364 .
[25] 李湘民, 胡白石, 许志刚, MEW T. W.. 拮抗细菌Bacillus subtilis B5423-R 抑制水稻纹枯病的阈值群体数量[J]. 中国水稻科学, 2003, 17(4): 360-364 .
[26] 卢德赵, 祝水金, 钱前, 王慧中, 颜美仙, 黄大年. BADH基因转化水稻的方法比较[J]. 中国水稻科学, 2003, 17(4): 323-327 .
[27] 沈文飚, 俞伟伟, 汪仁, 江玲, 翟虎渠, 程式华, 万建民,. 胡萝卜素漂白法快速筛选耐储藏水稻品种[J]. 中国水稻科学, 2003, 17(4): 387-389 .
[28] 胡培松, 翟虎渠, 唐绍清, 万建民. 稻米糊化温度和直链淀粉含量的简易测定法[J]. 中国水稻科学, 2003, 17(3): 284-286 .
[29] 肖昕, 陈奕, 罗文永, 刘彦卓, 毛兴学, 李晓方. 单粒活体稻谷种子直链淀粉含量的近红外透射光谱分析[J]. 中国水稻科学, 2003, 17(3): 287-290 .
[30] 郑爱萍, 李 平 , 王世全, 王玲霞, 马炳田. 水稻纹枯病菌拮抗菌B34分离鉴定及杀菌蛋白的获得[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(4): 356-360 .
[31] 余雪芳 , 谢关林 , J. SWINGS , T. W. MEW . 一个主栽粳稻品种的不同种植方式与稻纹枯病拮抗细菌的消长及种类的关系[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(4): 351-355 .
[32] 何青芳, 陈卫良, 马志超. 枯草芽孢杆菌A30菌株产生的拮抗肽的分离纯化与理化性质研究[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(4): 361-365 .
[33] 刘泽文, 韩召军, 张玲春, 王荫长. 稻飞虱饲养与抗药性筛选的方法研究[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(2): 167-170 .
[34] 檀根甲, 王子迎. 水稻纹枯病时间与空间生态位的研究[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(2): 182-184 .
[35] 唐家斌, 马炳田, 王玲霞, 李 平, 郑爱萍, 陈 红. 用木霉、类木霉对水稻纹枯病进行生物防治的研究[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(1): 63-66 .
[36] 汪秀峰, 杨剑波, 向太和, 李 莉, 倪大虎. 一种叶片直接用作PCR扩增的新方法及其应用[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(1): 67-70 .
[37] 陈宗祥, 邹军煌, 韩月澎 , 徐敬友, 童蕴慧, 于恒秀, 张亚芳, 潘学彪. 抗水稻纹枯病遗传研究的改良方法及其验证[J]. 中国水稻科学, 2002, 16(1): 74-76 .
[38] 苏祖芳, 周培南, 许乃霞, 张亚洁. 密肥条件对水稻氮素吸收和产量形成的影响[J]. 中国水稻科学, 2001, 15(4): 281-286 .
[39] 萧浪涛, 李东晖 , 蔺万煌, 洪 彬, 洪亚辉. 一种测定稻米垩白性状的客观方法[J]. 中国水稻科学, 2001, 15(3): 206-208 .
[40] 唐 健, 平霄飞, 汤富彬, 杨保军. 用气质联谱测定褐飞虱体内的保幼激素[J]. 中国水稻科学, 2001, 15(2): 142-144 .
[41] 包劲松, 舒庆尧, 吴殿星, 夏英武. 用糙米粉代替精米粉测定淀粉粘滞性的效果研究[J]. 中国水稻科学, 2001, 15(2): 145-146 .
[42] 魏兴华 ,汤圣祥 ,余汉勇 ,江云珠 ,裘宗恩 . 中国粳稻地方种资源核心样品的构建方法研究[J]. 中国水稻科学, 2000, 14(4): 237-240 .
[43] 程式华. 杂交水稻育种材料和方法研究的现状及发展趋势[J]. 中国水稻科学, 2000, 14(3): 165-169 .
[44] 李 莉,杨剑波,D. J. Mackill,P. M. Colowit. 水稻SSR不同检测和分析方法的比较研究[J]. 中国水稻科学, 2000, 14(3): 185-188 .
[45] 吴伟明,宋祥甫,邹国燕. 利用水上栽培方法研究水稻根系[J]. 中国水稻科学, 2000, 14(3): 189-192 .
[46] 陈志谊,许志刚,高泰东,倪寿坤,严大富,陆 凡,刘永锋. 水稻纹枯病拮抗细菌的评价与利用[J]. 中国水稻科学, 2000, 14(2): 98-102 .
[47] 樊龙江, 胡秉民, 许德信. 水稻区域试验点对品种判别能力估计方法的研究[J]. 中国水稻科学, 2000, 14(1): 58-60 .
[48] 孙岩松,张淑华,张云江. 寒地水稻花培育种选择效率分析[J]. 中国水稻科学, 1999, 13(3): 176-178 .
[49] 戴陆园,叶昌荣,熊建华,王怀义. 稻耐冷性鉴定评价方法[J]. 中国水稻科学, 1999, 13(1): 62-62 .
[50] 陈志谊 ,T. W. Mew . 在水稻生态系统中纹枯病拮抗细菌的分布和种类[J]. 中国水稻科学, 1998, 12(1): 35-39 .
[51] 秦厚国,叶正襄,李 华. 稻茎毛眼水蝇幼虫密度估计方法的研究[J]. 中国水稻科学, 1996, 10(3): 185-188 .
[52] 吴良欢, 吴平, 方萍, 陶勤南. 水稻肥料试验误差差数经验分布及在产量比较中的应用[J]. 中国水稻科学, 1995, 9(4): 230-234 .
[53] 杨 炜, 毕学知,黄大年, 肖翊华. 水稻蛋白质的双向电泳分析技术[J]. 中国水稻科学, 1993, 7(1): 43-47 .
[54] 卢扬江, 郑康乐. 提取水稻DNA的一种简易方法[J]. 中国水稻科学, 1992, 6(1): 47-48 .
[55] 潘 军,裘凌沧,段彬伍. 微波消化-等离子体发射光谱仪法分析稻米中无机元素的研究[J]. 中国水稻科学, 1991, 5(2): 87-90 .
[56] 朱智伟,林榕辉. 碱氧化消化法快带测定谷壳中的硅[J]. 中国水稻科学, 1990, 4(2): 89-91 .
[57] 谢少平,倪晋山. 不同籼稻品种整株幼苗根系K+吸收和H+释放的关系:一种筛选高效K+吸收水稻品种的方法[J]. 中国水稻科学, 1990, 4(1): 22-26 .
[58] 张志涛, E A Heinrichs, F G Medrano. 水稻品种抗褐稻虱的改进筛选法及其应用[J]. 中国水稻科学, 1986, 1(1): 74-79 .
版权所有 © 《中国水稻科学》编辑部 浙ICP备05004719号-5
地 址:浙江省杭州市体育场路359号   邮 编:310006   电 话:0571-63370278   E-mail:cjrs@263.net
本系统由北京玛格泰克科技发展有限公司设计开发  技术支持:support@magtech.com.cn